一、目的
1．掌握地下水硝酸盐氮同位素的前处理方法
2．了解气体同位素质谱计的使用和氮同位素的测定

二、原理
细菌反硝化方法测定的是天然含量下地下水中硝酸盐氮、氧同位素组成，应用反硝化细菌将水中硝酸盐转化为N2O气体，直接将N2O气体送入气体质谱计测定氮同位素组成。典型的细菌反硝化过程包括以下四步：
NO3－—NO2－—NO—N2O—N2（从左到右为细菌反硝化过程中的生成物）
每一步都受一种独特基因编码的霉的控制。试验采用的反硝化细菌缺乏N2O活性酶，这种N2O活性酶可以将N2O转化为N2气。因此，细菌反硝化方法的基本原理是：将天然浓度硝酸盐的水样中加入缺乏N2O活性酶的反硝化细菌，在反硝化细菌作用下，将水中硝酸盐全部转化成N2O气体，分离纯化出N2O气体直接送入气体质谱计中测试氮同位素组成。

三、仪器
1．细菌培养系统
2．气体分离纯化系统
3．MAT-251气体质谱计（仅参观）

四、实验步骤
1．反硝化菌株的选取
经反复实验，我们选择了两种缺乏N2O活性霉的反硝化细菌：P. chlororaphis（ATCC#43928）和P. aureofaciens（ATCC#13985）。两种菌群用于反硝化法测定硝酸盐氮同位素的反应时间和本底基本相同，效果都很好。但是P. aureofaciens可以同时用作硝酸盐氧同位素的分析，而P. chlororaphis不行。
2．反硝化菌的培养
将含胰蛋白酶的大豆肉汤用10mM硝酸钾、1mM硫酸氨和1ml/L防沫剂进行改造，取出其中400ml的溶解液放入500ml的锥形瓶中进行热压处理（热压处理后可以至少保存1个月），将P. chlororaphis或P. aureofaciens菌株嫁接在热压处理后的含胰蛋白酶的大豆琼脂培养基中，封紧锥形瓶，在室温下培养，一般要在摇床上培养6～10天。含胰蛋白酶的大豆肉汤中的有机氮和加入培养液中的氨提供了细菌用于消化的氮，使得样品中的硝酸盐免被细菌群吸收。6天的发酵时间足以消耗掉锥形瓶中的残余氧气和用于该进的硝酸盐，而对于P. chlororaphis，4到5天的嫁接时间就足够了。
3．N2O的转化
将培养液分成每份40mL冷冻离心分离，倒出上层清夜至4mL，分成两份分别注入20ml的顶空小瓶中，小瓶用聚四氟乙烯硅脂片盖上并拧紧。
为了去除残留的N2O气体和确保厌氧环境，对每个封闭小瓶用N2气至少净化2小时，氮气流速10～20ml/min。
用注射器将水样注入小瓶中，加入的样品量以最后得到10～20 nmol氮为宜，但最好不要超过10 ml。加入水样后，小瓶中细菌嫁接一晚直至水样中硝酸盐完全转化为N2O气体。
经过一夜嫁接，向小瓶中注入01～0.2 ml NaOH（10N），使得pH值大于12，消散细菌，终止反应，同时吸收产生的CO2。
4．N2O提取与同位素分析
用氦载气将N2O气体从样品小瓶中剥离、纯化，然后送入气体质谱计中测定氮同位素组成。通常采用两种方法，一种方法是全自动系统，用改进的Finnigan GasBench和DeltaPlus直接在线剥离、纯化和同位素测定。另一种方法是手动系统，包括三个部分：剥离系统（图1）、气相色谱分离、气体质谱计测定（如MAT251）。剥离系统的操作如下：

图1 N2O剥离系统

（1）打开所有活塞，冷阱处套上－70℃酒精液氮杯，调节氦气流量80 ml/min，让整个系统用氦气净化5分钟；
（2）调节氦气流量至20 ml/min，在U形管处套上－196℃液氮杯，将两个针头快速插进样品小瓶中，其中长针头在小瓶中水样液面下。
（3）关闭开关活塞，让氦气剥离样品小瓶中气体15分钟。
（4）关闭U形管两端活塞，取下U形管和样品小瓶，准备剥离下一个样品。
将U形管气体样品管连上气相色谱，使用氦载气，进一步分离N2O与CO2气体，得到不含CO2的纯N2O气体。
5．将不含CO2的纯N2O气体送入气体质谱MAT251。